IHC（免疫組化）融合了免疫學原理（抗原抗體特異性結合）和組織學技術（組織的取材、固定、包埋、切片、脫蠟、水化等），通過化學反應使標記抗體的顯色劑 （熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色，來對組織（細胞）內抗原進行定位、定性及定量的研究（主要是定位）。IHC 實驗注意事項：

1. 組織取材

為避免蛋白丟失及組織受損引起的非特異試劑吸附，取材須快速（組織塊也不宜太大）且要盡量避免人為損傷。

2. 固定

固定要及時、，但也不能固定過久。實驗證明甲醛固定時間越久的組織越容易出現自發熒光及非特異性染色。一般以 12~36 小時*。

3. 石蠟片與冰凍片的選擇

石蠟片制作對設備要求較冰凍片低，組織結構更好，保存條件簡單時間也久。但對部分蛋白有較強烈的破壞作用，對蛋白保護較冰凍片差。冰凍片對蛋白的保護較石蠟片好，制作起來也較快。

4. 滅活

過氧化物酶（HRP）系統的一定要做內源性過氧化物酶的滅活，而對于堿性磷酸酶（AP）系統和免疫熒光這個步驟不需要做。

5. 抗原修復

不同的樣本、不同的蛋白其*的抗原修復方式會有所區別，熱修復（酸性修復液（檸檬酸鹽修復液）、堿性修復液（EDTA 修復液）及酶修復（蛋白酶）都可做嘗試。對于陳舊的樣本要增加修復強度，比如延長修復時間。

6. 封閉

常用的封閉液有 5% BSA 和血清。BSA 是通用型的封閉液。血清應選擇與二抗同源的血清。

7. 抗體孵育

一抗一定要與實驗及樣本匹配的，孵育條件以 4 ℃ **。二抗應匹配一抗，37 ℃ 孵育半小時即可。

8. 顯色

DAB 顯色建議在鏡下控制反應時間，在陽性及背景之間選擇平衡點。

9. 結果觀察

建議在數據庫中查詢準確的表達部位。